猕猴桃原浆中维生素C与铁吸收协同效应的细胞模型验证

猕猴桃原浆富含维生素C（抗坏血酸）与可溶态铁，其中维生素C作为经典的铁吸收促进剂，可通过将三价铁（Fe³⁺）还原为二价铁（Fe²⁺）、螯合铁离子减少沉淀等机制提升铁的生物利用率。采用细胞模型验证两者的协同效应，是一种精准、高效的体外研究手段，常用模型为人肠上皮细胞系Caco-2细胞——该细胞在体外培养后可分化为具有刷状缘结构的单层上皮细胞，其形态与功能均模拟人体小肠黏膜上皮细胞，能直观反映肠道对铁的吸收过程，为协同效应的机制解析提供可靠数据支撑。

一、实验前准备：细胞模型构建与样品预处理

1. Caco-2细胞模型的建立与分化

将Caco-2细胞接种于Transwell小室的上层滤膜上，培养基采用含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸的DMEM高糖培养基，置于37℃、5% CO₂的恒温培养箱中培养。前3天每日更换培养基，待细胞贴壁融合后，继续培养18～21天，期间每2天更换一次培养基，直至细胞完全分化为极性单层上皮细胞。

分化完成后需验证模型有效性：检测跨上皮细胞电阻值（TEER），当TEER值稳定在400～600 Ω·cm²时，表明细胞单层致密无渗漏；同时可通过免疫荧光染色检测细胞刷状缘标志物（如碱性磷酸酶）的表达，确认模型符合肠道上皮的生理特性。

2. 猕猴桃原浆的样品预处理

为排除杂质干扰，需对猕猴桃原浆进行预处理：将原浆经高速离心（10000 r/min，15 min）去除果肉残渣，取上清液过0.22 μm滤膜除菌；随后采用超滤法去除大分子蛋白与多糖，保留含维生素C与可溶性铁的小分子组分。

同时，需测定预处理后样品中的维生素C含量（采用2,6-二氯靛酚滴定法或高效液相色谱法）与铁含量及价态（采用原子吸收分光光度法检测总铁，邻菲罗啉比色法区分Fe²⁺与Fe³⁺），为后续实验浓度设定提供依据。此外，需设置对照组：单独的Fe³⁺溶液（如柠檬酸铁铵溶液）、单独的维生素C溶液、以及不含维生素C的猕猴桃原浆超滤液（通过加热破坏维生素C制备）。

二、实验设计：分组处理与铁吸收检测

1. 实验分组与处理

将分化成熟的Caco-2细胞模型分为4组，每组设置3个复孔，确保实验重复性：

·对照组：上层小室加入不含铁的基础培养基；

·单独Fe³⁺组：上层小室加入含Fe³⁺的培养基（Fe³⁺浓度与猕猴桃原浆中总铁浓度一致）；

·Fe³⁺+维生素C组：上层小室加入含相同浓度Fe³⁺与维生素C的培养基（维生素C浓度与猕猴桃原浆中含量一致）；

·猕猴桃原浆组：上层小室加入预处理后的猕猴桃原浆超滤液，保留天然的维生素C与铁的配比。

将细胞置于培养箱中孵育2～4小时，期间维生素C可充分发挥还原与螯合作用，模拟肠道内的铁吸收过程。孵育结束后，吸弃上层小室的培养基，用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻冲洗细胞表面，去除未被吸收的铁离子。

2. 铁吸收量的检测方法

细胞内铁含量测定：采用硝酸-高氯酸消解法处理细胞，将细胞裂解液经高温消解后，利用原子吸收分光光度计测定消解液中的铁浓度，计算单位质量细胞内的铁积累量，直接反映细胞对铁的吸收效率。

铁转运效率评估：检测Transwell小室下层培养基中的铁浓度——下层培养基模拟肠道毛细血管侧的环境，其铁含量代表经细胞转运的铁量。通过对比上层铁初始浓度与下层铁浓度，计算铁的转运率，评估维生素C对铁跨膜转运的促进作用。

细胞内铁还原酶活性检测：维生素C可增强细胞内铁还原酶的活性，进一步促进Fe³⁺还原。采用硝基蓝四唑法测定细胞内铁还原酶的活性，对比各组酶活性差异，解析协同效应的分子机制。

三、协同效应的验证与结果分析

1. 协同效应的判定标准

对比4组实验的细胞内铁积累量与铁转运率，若出现以下结果，则可验证维生素C与铁的协同吸收效应：

·单独Fe³⁺组的细胞铁吸收量与转运率显著低于Fe³⁺+维生素C组与猕猴桃原浆组，表明维生素C可显著提升Fe³⁺的吸收效率；

·猕猴桃原浆组的铁吸收量与转运率略高于Fe³⁺+维生素C组，原因是猕猴桃原浆中除维生素C外，还含有柠檬酸、苹果酸等有机酸，这些成分可与维生素C协同螯合铁离子，进一步促进铁吸收；

·不含维生素C的猕猴桃原浆组铁吸收量显著下降，直接证明维生素C是猕猴桃原浆中促进铁吸收的核心成分。

2. 协同机制的细胞层面解析

从细胞模型实验结果可进一步推导协同机制：

还原作用：维生素C可穿透Caco-2细胞膜进入细胞内，或在细胞表面将培养基中的Fe³⁺还原为Fe²⁺——Fe²⁺更易被肠道上皮细胞的铁转运蛋白1（DMT1）识别并吸收，从而提升铁的摄取效率；

螯合作用：维生素C与铁离子形成稳定的可溶性螯合物，避免Fe³⁺在中性或弱碱性环境下与磷酸根、碳酸根等形成不溶性沉淀，保证铁离子在肠道内的溶解状态，便于细胞吸收；

上调转运蛋白表达：长期培养实验中可发现，维生素C能促进Caco-2细胞中DMT1与基底侧膜铁转运蛋白（FP1）的表达，增强细胞对铁的摄取与转运能力，这也是协同效应的重要分子基础。

四、实验注意事项与结果优化

避免维生素C氧化：维生素C在光照、高温、有氧条件下易分解，样品预处理与实验孵育过程需在避光、低温环境下进行，同时可在培养基中添加少量抗氧化剂（如谷胱甘肽），维持维生素C的活性。

控制铁离子浓度：铁离子浓度过高会对细胞产生毒性，导致细胞凋亡，需预实验确定无细胞毒性的铁浓度范围，确保实验结果的可靠性。

排除其他成分干扰：若需单独验证维生素C的作用，需制备去除维生素C的猕猴桃原浆对照组，同时设置不同维生素C浓度梯度组，明确维生素C浓度与铁吸收效率的量效关系。

结合动物实验验证：细胞模型实验仅能反映体外吸收过程，后续可通过动物实验（如缺铁性贫血小鼠模型）进一步验证猕猴桃原浆中维生素C与铁的协同效应，为实际应用提供更全面的依据。

五、应用价值

该细胞模型验证实验不仅明确了猕猴桃原浆中维生素C与铁的协同吸收机制，还为开发富含天然铁与维生素C的功能性饮品提供了实验依据。基于此结果，可通过优化猕猴桃原浆的加工工艺，保留更多的维生素C与可溶性铁，开发针对缺铁性贫血人群的营养补充剂，具有重要的食品营养与健康应用价值。

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